典型纳米材料致大鼠中枢神经系统和多巴胺能神经元的毒性效应研究

【摘要】研究背景及研究目的：帕金森病(Parkinson’sdisease，PD)是中老年人常见的神经退行性疾病之一。其病因主要有遗传因素和环境因素。其主要病理表现是黑质纹状体多巴胺能神经元（DopaminergicNeuron,DN）的变性死亡及神经元胞浆中路易小体(Lewy’sbody)的积聚，引起多巴胺（Dopaminergic，DA）分泌不足，纹状体DA水平下降。在PD患者中散发性病例约占95%，他们对外界环境毒素存在易感因素。随着纳米科学和纳米技术的迅猛发展，纳米材料被大规模生产和广泛应用，人们通过环境、生态、工作场所暴露于各种纳米颗粒和纳米材料的机会和程度也日益增加。由于纳米颗粒具有小尺度效应和表面效应以及由其所造成的巨大比表面积，使其表面有可能产生较多的活性位点来参加不同的生化反应，故具有强大的穿透组织细胞的能力、较强的氧化能力和催化能力。最近研究表明，中枢神经系统（centralnervoussystem，CNS)是纳米颗粒的潜在毒作用靶器官。纳米颗粒能穿越血脑屏障进入中枢神经系统，对脑组织造成损伤。吸入暴露后，在鼻腔黏膜上吸附并沉积的纳米颗粒可经嗅神经通路进入脑组织。虽然纳米材料的环境健康效应已得到高度关注，但纳米材料的神经毒性研究还处于起步阶段，尤其是针对多巴胺能神经元的毒性效应及其机制尚未明了，特别是体内和体外实验相结合的系统性研究的资料和数据十分有限。本研究即对不同类型纳米材料的中枢神经系统毒性进行了比较，包括两部分研究内容。在第一部分研究中选择了碳纳米材料-单臂碳纳米管(single-wallcarbonnanotubes，SWCNTs)、非金属纳米氧化物-纳米二氧化硅（SiO2-NPs）和金属纳米氧化物-纳米氧化锌(ZnO-NPs)3种不同种类的纳米材料，通过检测非暴露式气管滴注染毒后大鼠脑组织神经递质和氧化应激水平，对其中枢神经系统毒性进行了比较。在第二部分研究中，在整体动物水平上，研究了纳米氧化铝（Al2O3-NPs）、纳米氧化铜（CuO-NPs）和纳米氧化锌(ZnO-NPs)3种典型纳米金属氧化物经鼻腔滴注暴露后在大鼠中枢神经系统主要功能脑区的分布以及对相应脑区的损伤作用；在细胞水平上对3种纳米金属氧化物致多巴胺能神经元模型（PC12细胞）的毒性效应及其机制进行了初步探讨，为进一步进行作用机制的研究及纳米颗粒经呼吸暴露后对机体的毒性效应评价提供科学依据，为PD等神经退行性病变的病因学研究提供实验参考，为纳米材料环境健康防护标准的制定提供基础数据资料。研究内容：(1)研究3种不同种类纳米材料对非暴露式气管滴注染毒大鼠的神经毒性效应；(2)研究3种典型纳米金属氧化物经鼻腔滴注在大鼠中枢神经系统主要功能脑区的分布；(3)研究3种典型纳米金属氧化物经鼻腔滴注对大鼠大鼠中枢神经系统主要功能脑区的毒性效应；(4)研究3种典型纳米金属氧化物对多巴胺能神经元PC12细胞的毒性效应；(5)CuO-NPs致多巴胺能神经元PC12细胞毒性作用潜在机制的初步探讨。研究方法：(1)纳米材料染毒悬液的制备及参数表征：SWCNTs、SiO2-NPs、Al2O3-NPs、CuO-NPs和ZnO-NPs，以生理盐水为分散剂制备纳米颗粒悬液，透射电镜和扫描电镜观察纳米颗粒的分散状态，并对其粒径、形状和化学组成等基本颗粒参数进行表征。(2)3种不同种类纳米材料对大鼠神经毒性研究：SPF级雄性Wistar大鼠非暴露式气管滴注SWCNTs、SiO2-NPs、ZnO-NPs，分为生理盐水对照组和3种纳米材料的高（15mg/kg体重）、低（3mg/kg体重）剂量组，隔日染毒1次，共4周。采用生物化学法检测大鼠脑组织氧化损伤指标丙二醛（MDA)、还原型谷胱甘肽（GSH）的含量及超氧化物歧化酶(SOD）的活性。采用高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography,HPLG)检测单胺类神经递质：肾上腺素(E)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)及其代谢产物5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)含量及氨基酸类神经递质谷氨酸(Glu)、天门冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)、γ-氨基丁酸(GABA)含量。并将脑组织切片，苏木精一伊红(HE)染色后光镜下进行组织形态学检查。(3)通过动物整体实验研究3种纳米金属氧化物在大鼠主要脑区的分布：采用鼻腔滴注方式对SPF级雄性Wistar大鼠进行染毒，分为生理盐水对照组和3种纳米材料暴露组（20mg/kg体重，每组5只），每天滴注1次，共15天。利用电感耦合等离子体质谱法（inductivelycoupledplasmamassspectrometry，ICP-MS）分别检测大鼠嗅球、海马、纹状体、大脑皮质、小脑组织中AL、Cu、Zn元素的含量；利用透射电镜（transmissionelectronmicroscope，TEM）观察嗅球、海马、纹状体组织超微结构的变化及纳米颗粒在组织中的定位。(4)通过动物整体实验研究3种纳米金属氧化物对大鼠主要脑区的毒性效应：采用鼻腔滴注方式对SPF级雄性Wistar大鼠进行染毒，分为生理盐水对照组和3种纳米材料暴露组（20mg/kg体重，每组5只），每天滴注1次，共15天和30天。染毒期间观察大鼠体重变化；染毒结束利用生物化学法检测大鼠嗅球、海马、纹状体、大脑皮质、小脑组织匀浆液中MDA含量、GSH活性，反应各脑区氧化应激水平；通过双抗夹心酶联免疫法（ELISA）检测上述脑区组织匀浆中细胞因子白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平，反应各脑区免疫炎性水平。(5)通过体外细胞实验研究纳米材料对多巴胺能神经元PC12细胞的毒性效应：以细胞培养液配制3种纳米颗粒混悬液：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20μg/mLZnO-NPs混悬液；5、10、15、20、25、30、35、40、45、50μg/mLCuO-NPs混悬液；3.125、6.25、12.5、25、50、100、200μg/mLAl2O3-NPs混悬液。分别与PC12细胞共培养，通过细胞形态学观察、CCK-8实验和乳酸脱氢酶（LDH）渗漏分析评价纳米材料对细胞活性和细胞膜完整性的影响；通过AnnexinV-FITC/PI双染结合流式细胞术分析细胞凋亡。通过碘化丙啶（PI）单染结合流式细胞术分析Al2O3-NPs、CuO-NPs致PC12细胞周期的变化；通过比色法检测CuO-NPs暴露后PC12细胞裂解液中MDA、一氧化氮（NO）含量、总超氧化物歧化酶（SOD）、GSH、总GSH活性，探讨CuO-NPs是否通过氧化应激机制引发PC12细胞毒损伤。研究结果：1纳米颗粒的参数表征5种纳米材料粒径均<40nm，纯度在99.7%以上，Al2O3-NPs和CuO-NPs为规则球形颗粒，SiO2-NPs、ZnO-NPs为六边形晶体结构，SWCNTs为束状纤维，直径约8nm，管长小于5μm，符合实验要求。2整体动物水平实验研究(1)3种不同种类纳米材料对大鼠神经毒性研究：非暴露式气管滴注染毒4周后，SWCNTs低剂量组大鼠脑组织MDA含量显著升高，高、低剂量组SOD活性均显著降低；ZnO-NPs高、低剂量组MDA含量均显著升高，高剂量组SOD活性显著降低。ZnO-NPs高、低剂量组抑制性单胺类神经递质DA、5-HT和5-HIAA含量均显著降低；SWCNTs高剂量组DA含量显著降低。ZnO-NPs高剂量组兴奋性氨基酸类神经递质Glu含量显著升高；SWCNTs高剂量组Glu、Asp含量显著升高；SiO2-NPs高、低剂量组Asp含量及低剂量组Glu含量显著升高。ZnO-NPs高剂量组大鼠脑组织可见炎细胞浸润。。(2)3种纳米金属氧化物在大鼠脑组织中的分布：Al2O3-NPs、CuO-NPs和ZnO-NPs分别经鼻腔滴注暴露15d后，ICP-MS检测发现大鼠嗅球、海马和纹状体组织中Al、Cu元素含量显著升高，大脑皮质和小脑组织中Al、Cu元素含量有升高的趋势，但没有显著性差异；各脑区中Zn元素含量有升高的趋势，但没有显著性差异。同时TEM检测发现3种纳米从材料染毒组大鼠嗅球、海马、纹状体组织胞核和胞浆内有纳米颗粒沉积，并造成相应脑区神经纤维排列疏松、核膜缺损、染色质凝集、线粒体损伤、胞浆内形成空泡，甚至细胞坏死。(3)3种纳米金属氧化物对大鼠脑组织的毒性作用：3种纳米颗粒暴露均可造成大鼠体重显著降低。3种纳米材料暴露15d后，大鼠嗅球、海马、纹状体组织中GSH含量显著降低，MDA的含量显著升高；且ZnO-NPs亦可致大脑皮质GSH含量显著降低。3种纳米材料暴露30d后，大鼠嗅球、海马、纹状体、大脑皮质组织中GSH含量显著降低，嗅球、海马、纹状体组织中MDA的含量显著升高；且ZnO-NPs亦可造成小脑GSH含量显著降低，大脑皮质和小脑MDA含量显著升高；CuO-NPs亦可造成大脑皮质MDA的含量显著升高。3种纳米材料暴露15、30d后，大鼠嗅球、海马、纹状体组织IL-1β、TNF-α水平显著升高，且ZnO-NPs亦可造成小脑组织TNF-α水平显著升高；Al2O3-NPs暴露30d后亦可造成大脑皮质、小脑组织中TNF-α水平显著升高。3体外细胞水平实验研究(1)形态学：对照组PC12细胞(分化型)形态正常，突起较长，细胞间突起连接点较多，胞质透明度较大。染毒组出现不同程度的回缩变形，变圆漂浮、饱核固缩、胞内形成许多空泡；细胞突起变短减少，甚至消失，细胞间突起连接点减少；胞质内颗粒物增多，透明度下降，细胞间隙和细胞表面有纳米颗粒分布，对细胞的生长和代谢造成显著影响，导致活细胞数明显减少。ZnO-NPs和CuO-NPs暴露后对PC12细胞形态学的影响尤为严重。(2)细胞毒性：3种纳米颗粒可显著降低PC12细胞活性，且呈现剂量依赖性和时间依赖性，在实验暴露时间内低剂量(<10μg/mL)的ZnO-NPs对PC12细胞不产生毒性作用，而当暴露剂量超过一定限值（>12μg/mL）时即可造成PC12细胞大量死亡。3种纳米颗粒可造成细胞培养液上清中LDH活性显著升高，且CuO-NPs在低剂量(5μg/mL)时即已经显著高于对照组，而Al2O3-NPs和ZnO-NPs对胞外LDH释放的作用较弱。(3)细胞周期和细胞凋亡：3种纳米颗粒可引发PC12细胞凋亡和坏死，低剂量、短时间暴露时细胞凋亡在细胞死亡进程中发挥主导作用，而随着染毒时间的延长和染毒剂量的增加细胞坏死逐渐发挥主导作用。Al2O3-NPs暴露24h可导致PC12细胞周期阻滞在G0/G1期，同时伴随着G2/M期细胞数量显著降低；低剂量(10μg/mL)CuO-NPs暴露可导致PC12细胞周期阻滞在G0/G1期，而随着暴露剂量(20、40μg/mL)的增加细胞周期则阻滞在S期，同时伴随着G2/M期细胞数的显著(4)CuO-NPs致PC12细胞氧化应激水平：各剂量水平的CuO-NPs暴露均可造成PC12细胞GSH水平显著降低；10~30μg/mL剂量暴露组PC12细胞总GSH水平显著降低；15~30μg/mL剂量暴露组PC12细胞总SOD活性显著降低，NO含量显著升高；20~30μg/mL剂量暴露组MDA含量显著升高，GSH/GSSG比值显著降低。研究结论：(1)3种不同类型的纳米材料气管滴注暴露后，ZnO-NPs和SWCNTs可致脑组织氧化损伤，抗氧化水平降低，清除自由基的能力显著下降；ZnO-NPs可影响抑制性单胺类神经递质DA、5-HT、5-HIAA和兴奋性氨基酸类神经递质Glu的合成与代谢，SWCNTs可影响DA和兴奋性氨基酸类神经递质Glu、Asp的合成与代谢，SiO2-NPs可影响Glu、Asp的合成与代谢，说明导致中枢神经系统功能损伤；且ZnO-NPs可对脑组织造成组织病理性损伤，出现炎细胞浸润。(2)3种纳米金属氧化物鼻腔滴注暴露后可沿嗅神经转运至中枢神经系统，引发大鼠中枢神经系统氧化应激和免疫炎性反应发生，造成脑组织超微结构损伤。氧化应激和免疫炎性反应可能是纳米颗粒引发神经毒性效应的主要作用机制之一，符合目前普遍认同的PD发病机制，提示这3种纳米颗粒可能会增加PD的易感性。(3)3种纳米金属氧化物可降低细胞活性；通过影响细胞膜的完整性和通透性抑制细胞活性；引起细胞凋亡；通过阻滞细胞周期抑制细胞增殖。同时可引发多巴胺能神经元PC12细胞形态学改变，使细胞突起变短，细胞间突起结点变少甚至消失，提示3种纳米颗粒可能通过损伤神经元的神经突起，导致神经细胞间的物质运输和信息传递无法正常进行，进而对生物体的神经系统功能造成损伤，导致中枢神经系统毒性。(4)CuO-NPs可致PC12细胞氧化应激水平升高，可能通过氧化应激机制引发PC12细胞毒性作用。并且造成PC12细胞内NO的含量急剧升高，提示，CuO-NPs可能会造成多巴胺能神经元对DA的代谢异常，进而导致神经元的神经调节功能损伤；另外，NO通过与细胞内的超氧阴离子合成强效的氧化剂-过氧亚硝基阴离子，对PC12细胞造成氧化损伤。(5)3种纳米金属氧化物和SWCNTs可能会增加PD的易感性，是PD的环境促进因素之一。(6)3种不同类型的纳米材料间比较，无机纳米金属氧化物ZnO-NPs毒性作用最强，碳纳米材料SWCNTs次之，无机纳米非金属氧化物SiO2-NPs毒性作用较小；3种纳米金属氧化物间比较，ZnO-NPs的毒性作用最强，CuO-NPs次之，其次是Al2O3-NPs；其差异可能与其结构特征及化学组成的不同有关。
【作者】刘焕亮；
【导师】袭著革；
【作者基本信息】中国人民解放军军事医学科学院，卫生毒理学，2014，博士
【关键词】纳米材料；PC12细胞；脑组织分布；中枢神经系统毒性；神经细胞毒性；

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